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    • 专利摘要:
    Beschriebenwird ein Protein, das nicht methylierte CpG-Motive bindet, wobeies eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweistund gegenüberdiesem verkürztist, wobei die Bindungsstelle fürnicht methylierte CpG-Motive erhalten ist. Des weiteren betrifftdie Anmeldung ein Verfahren zur Trennung und/oder Anreicherung prokaryonterDNA mit den Schritten a) Kontaktieren mindestens einer in Lösung befindlichenprokaryonten DNA mit einem erfindungsgemäßen Protein, wodurch ein Protein-DNA-Komplexgebildet wird, und b) Separation des Komplexes.
    公开号:DE102004010928A1
    申请号:DE200410010928
    申请日:2004-03-05
    公开日:2005-09-22
    发明作者:Hans-Peter Dr. Deigner；Stefan Dr. med. Rußwurm；Svea Sachse；Karl-Hermann Dr.Rer.Nat.Habil. Schmidt；Eberhard Prof. Dr. Med. Straube
    申请人:SIRS Lab GmbH；
    IPC主号:C07K14-435
    专利说明:
    [0001] DieErfindung betrifft ein Protein, das nicht methylierte Cytidin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotide (CpG-Motive)einer DNA bindet, eine dafürkodierende Nukleinsäure,ein Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins zur Trennung und/oderAnreicherung prokaryonter DNA bzw. zur Abreicherung dieser DNA ausphysiologischen Flüssigkeitensowie einen Kit zur Durchführungder Verfahren.
    [0002] DurchBakterien verursachte Infektionen sind eine der häufigstenUrsachen fürEntzündungskrankheiten.Zur Prognose des Krankheitsverlaufes sowie insbesondere zur rechtzeitigenAuswahl geeigneter therapeutischer Maßnahmen ist der frühzeitigeNachweis der bakteriellen Erreger von entscheidender Bedeutung.
    [0003] ZumNachweis bakterieller Erreger werden auch heute noch hauptsächlich verschiedenekulturabhängigeMethoden angewendet. Eine Vielzahl von Nachteilen dieser Methodenführtendazu, daß geradein der letzten Dekade parallel zur stürmischen technologischen Entwicklungder Molekularbiologie verstärktnach Alternativen gesucht wurde. Erste Berichte zum Einsatz kulturunabhängiger Nachweisverfahrenbakterieller Erreger, welche auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktionberuhen, stammen vom Anfang der 90er Jahre. So konnten beispielsweiseMiller und Kollegen (Miller N J Clin Microbiol. 1994 Feb; 32(2):393–7)zeigen, dass kulturunabhängigeVerfahren den klassischen Kultivierungs- und Mikroskopietechnikenbeim Nachweis von Mycobacterium tuberculosis überlegen sind. In letzter Zeithaben aber weitere molekularbiologische Methoden, die auf dem Nachweiserregerspezifischer Nukleinsäurenbasieren, an Bedeutung gewonnen (z.B: M. Grijalva et al. Heart 89(2003) 263–268;Uyttendaele M et al. Lett Appl Microbiol. 2003; 37(5): 386–91; Saukkoriipi Aet al. Mol Diagn. 2003 Mar; 7(1): 9–15; Tzanakaki G et al. FEMSImmunol Med Microbiol. 2003 Oct 24; 39(1): 31–6;).
    [0004] Nebender hohen Spezifitätsolcher molekularbiologischer Methoden ist der geringe Zeitbedarfals wesentlicher Vorteil gegenüberkonventionellen kulturabhängigenMethoden zu nennen. Allerdings ist die Sensitivität des Nachweisesprokaryonter DNA direkt aus Körperflüssigkeitenund nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial im Vergleich zurKultur der Mikroorganismen bislang viel zu gering. Eine für den direktenErregernachweis aus nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial ausreichendeMenge an Nukleinsäurenvon Bakterien wird allenfalls im Bereich der 16S-rRNA-Analyse mittelsPCR der 16S Region auf dem bakteriellen Chromosom und der anschließenden Sequenzanalysedes PCR Fragments erreicht, da sich meist mehrere Kopien für den die16S-rRNA kodierenden Abschnitt auf dem Chromosom befinden. Der direktespezifische Erregernachweis mittels 16S-rRNA-Analyse setzt voraus,dass sich nur eine Erreger-Spezies in der zu untersuchenden Probebefindet. Befinden sich verschiedene Erreger-Spezies in der Probe, ist ein spezifischer Nachweis über Sequenzierungder 16S-rRNA-Region nicht möglich,da die verwendeten Primer universell für die meisten Bakterien sind.Ferner müssensich die nachzuweisenden Bakterien in der metabolischen Phase befindenund genügend16S-rRNA exprimieren.
    [0005] Davonist insbesondere bei Patienten, die unter einer kalkulierten antibiotischenTherapie stehen, in der Regel nicht auszugehen. Darüber hinauskommen bestimmte Pathogenitätsfaktorenvon Bakterien nicht zu jeder Zeit zur Expression, obwohl die entsprechendenGene im bakteriellen Genom vorhanden sind. Im Ergebnis werden demklinisch tätigenArzt falsch negative Befunde übermittelt.Dadurch kann eine gezielte antibiotische Therapie entweder gar nichtoder viel zu späteingeleitet werden. Der Arzt ist in solchen Fällen auf sein Erfahrungswissenund auf allgemeine Richtlinien (wie z.B. der Paul-Ehrlich-Gesellschaft)angewiesen und wird daher viel zu allgemein antibiotisch behandeln.Der nicht zielgenaue Einsatz von Antibiotika birgt eine Reihe vonRisiken nicht nur fürden einzelnen Patienten (wie z.B. unnötige Nebenwirkungen in Formvon Nierenschädenetc.), sondern auch fürdie gesamte Gesellschaft (z.B. die Entwicklung zusätzlicherAntibiotikaresistenzen wie MRSA (multiresistente Staphylococcusaureus, etc.). Deshalb bietet der Nachweis der klinisch bedeutsamenPathogenitätsfaktorenund Resistenzen von Bakterien auf chromosomaler und Plasmid-Ebene, alsoletztendlich auf DNA-Ebene, fürdie Diagnose vieler Infektionserkrankungen, aber auch der Sepsis,erhebliche Vorteile. Dies gilt umso mehr, da auf dieser Ebene aucheine Unterscheidung zwischen pathogenen und kommensalen Bakteriengetroffen werden kann.
    [0006] Amhäufigstenerfolgt der erregerspezifische Nukleinsäurenachweis durch Nukleinsäure-Amplifikationstechniken(NAT), wie beispielsweise die Vervielfältigung der prokaryonten DNAmittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bzw. der Ligase-Kettenreaktion(LCR). Der hohen Spezifitätund schnellen Verfügbarkeitder Ergebnisse stehen die Störanfälligkeitdurch Kontaminationen oder durch stark inhibierende Faktoren inklinischen Proben gegenüber.
    [0007] Beieinem herkömmlichenPCR-Nachweisverfahren muß für eine erfolgreicheDetektion von Erregern im Blut mindestens 1 Target-DNA des Erregersin 10 μlBlut vorhanden sein. Das entspricht ca. 100 Targets in 1 ml Blutbzw. 1000 Targets in 10 ml Blut.
    [0008] Andersverhältes sich mit der Blutkultur zum Nachweis von Erregern einer Infektion.Hier liegt die untere Nachweisgrenze bei etwa 3–5 Bakterien pro 10 ml.
    [0009] DieseNachweisgrenze wird derzeit mit PCR-Verfahren noch nicht erreicht,auch nicht mit solchen die ihre Zielsequenz im Bereich der 16S-rRNARegion auf dem Chromosom haben. Obwohl mehrere die 16S-rRNA kodierendeRegionen auf dem bakteriellen Chromosom lokalisiert sind, meist3 bis 6, bleibt die Voraussetzung, daß sich mindestens ein Molekül der Template-DNAim PCR-Reaktionsgemisch befindet. Eine verbesserte diagnostischeSicherheit ist von PCR-Verfahren zu erwarten, deren spezifischeZielsequenzen fürspeziesspezifische Proteine kodieren, entweder im Chromosom oderauf Plasmiden der Mikroorganismen. Auch hier trifft das Obengesagtezur Nachweisgrenze zu. Gerade unter dem Einfluß einer laufenden Antibiotikatherapiekann das Wachstum der Erreger stark verlangsamt oder eingeschränkt sein,auch wenn das eingesetzte Antibiotikum letztlich nicht wirksam ist.Diese Situation ist gerade bei solchen Patienten häufig anzutreffen,die bereits unter Antibiotikatherapie stehen und bei denen aus diesemGrund keine krankheitsverursachenden Bakterien aus den Blutkulturenoder anderen Proben (wie z.B. Trachealabstrichen, bronchoalveolären Lavagen(BAL) etc.) angezüchtetwerden können.
    [0010] Wegenunzureichender Sensitivitäthat der erregerspezifische Nukleinsäurennachweis ohne Amplifikationsschrittdurch direkten Nachweis der prokaryonten DNA (Sondentechnik, FISH-Technik) nur beiausreichend hoher Keimzahl im Untersuchungsmaterial diagnostischeBedeutung.
    [0011] Diewesentliche Problematik des Nachweises prokaryonter DNA zur Identifikationbakterieller Erreger in Körperflüssigkeitenbestehen neben PCR-hemmenden Bestandteilen im Untersuchungsmaterialvor allem im Überschuß von eukaryontergegenüberprokaryonter DNA. Hierbei sind insbesondere kompetitive Prozesse beider DNA-Analyse sowie die geringe Menge an prokaryonter DNA alshinderlich füreinen qualitativen und quantitativen Erregernachweis anzusehen.
    [0012] Die üblichenMethoden zur DNA-Isolierung reichern die Gesamt-DNA einer Körperflüssigkeitan, so daß dasVerhältnisWirts-DNA zu mikrobieller DNA zwischen 1:10–6 und1:10–8 betragenkann. Aus diesem Unterschied ist die Schwierigkeit des Nachweisesmikrobieller DNA in Körperflüssigkeitengut nachzuvollziehen.
    [0013] Eswäre alsowünschenswert,die prokaryonte DNA von eukaryonter DNA trennen und insbesondere gegenüber letztererauch anreichern zu können.
    [0014] Dervorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittelund Verfahren bereitzustellen, die die Trennung und/oder Anreicherungprokaryonter DNA aus Untersuchungsproben mit hohem Anteil eukaryonterDNA, insbesondere von Patienten mit Infektionen, ermöglicht.
    [0015] Erfindungsgemäß wird diesdurch ein Protein erreicht, das nicht methylierte CpG-Motive bindet,wobei es eine 25%ige bis 35%ige, insbesondere etwa 27,6%ige, Homologiezum Wildtyp-CGPB-Proteinaufweist, wobei die Bindungsstelle für nicht methylierte CpG-Motiveim erfindungsgemäßen Proteinenthalten ist, und es gegenüberdem Wildtyp-Protein verkürztist, vorzugsweise bis maximal zur Länge der Bindungsstelle für nicht methylierteCpG-Motive. Dies bedeutet, daß esnur maximal soweit verkürztist, daß dieBindungsstelle für nichtmethyliert CpG-Motive erhalten bleibt.
    [0016] AlsWildtyp-CGPB-Protein (oder CPGbP656) wird im folgenden das humaneCGPB-Protein (vgl. Voo et al., Mol Cell Biol. 2000 Mar; 20(6): 2108–21.) bezeichnet.Das erfindungsgemäße Proteinwird im folgenden als CPGbP181 bezeichnet. Das in EP 02020904 beschriebene Protein,das eine verkürzteVariante des Wildtyp-CGPB-Proteins ist und als Grundlage für das erfindungsgemäße Proteindiente, wird im folgenden mit CPGbP241 bezeichnet.
    [0017] DieErfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben,wobei
    [0018] 1 dieAminosäuresequenzvon CPGbP181 (fett dargestellt) verglichen mit dem Wildtyp-CGPB-Protein(CPGbP656) und dem CPGbP241 (kursiv dargestellt) zeigt;
    [0019] 2 dieDNA-Sequenz und Übersetzungin die Aminosäuresequenzdes kompletten CPG-bindenden Proteins CPGbP656 zeigt, wobei dieverkürztenCPG-bindenden Peptide CPGbP241 (fett) und CPGbP181 (kursiv) dargestelltsind;
    [0020] 3 einePCR von Streptokokken-DNA in Humanblut darstellt;
    [0021] 4 einenested PCR mit den PCR-Produkten aus dem Primär-PCR-Ansatz von 3 alsTemplate zeigt;
    [0022] 5 einGelretardierungsexperiment darstellt;
    [0023] 6 einweiteres Gelretardierungsexperiment wiedergibt;
    [0024] 7 dieElution von Kalbsthymus-DNA und pUC18emm an rCpG-181-Sepharose zeigt,und
    [0025] 8 dieDarstellung der Bestimmung der eluierten DNA in den Fraktionen durchMessung der Extinktion bei 254 nm in Abhängigkeit des NaCl-Gradientenist.
    [0026] DasWildtyp-CGPB-Protein CPGbP656 bindet nicht methylierte CpG-Motiveprokaryonter DNA, wobei ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird. Dieserkann z.B. auf einem Trägergebunden sein oder werden, wodurch eine Trennung und/oder Anreicherungder DNA erfolgen kann. Die vorliegende Erfindung basiert nun auf der überraschendenErkenntnis, das ein im Vergleich zum Wildtyp-CGPB-Protein (CPGbP656mit 656 Aminosäuren)erfindungsgemäßes Protein,insbesondere CPGbP181 mit 181 Aminosäuren, das eine 27,6%ige Homologiezum Wildtyp-CGPB-Proteinaufweist, eine verbesserte Bindungseigenschaft gegenüber nichtmethylierten CpG-Motiven prokaryonter DNA als das Wildtyp-CGPB-Proteinund Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie besitzt.
    [0027] ProkaryonteDNA unterscheidet sich von eukaryonter DNA beispielsweise durchdas Vorkommen nicht methylierter CpG-Motive (Deutsches Ärzteblatt,Jg. 98/15: A981-A985 (2001)). Die Erfindung basiert auf der Kenntnis,daß sicheukaryonte DNA und prokaryonte DNA durch ihren Anteil an CpG-Motivenunterscheiden. In der prokaryonten DNA befinden sich CpG-Motivein einem 20-fachen Überschuß im Vergleichzu eukaryonter DNA, die solche Motive nur übergangsweise enthält, z.B.in Krebszellen oder Promotorregionen ((Deutsches Ärzteblatt,Jg. 98/15: A981-A985 (2001)). In prokaryonter DNA sind diese Motivenicht methyliert, wohingegen sie in eukaryonter DNA zum größten Teilmethyliert sind, was die Unterschiedlichkeit nochmals erhöht. Nichtmethylierte CpG-Motive sind nicht methylierte Deoxycytidylat-Deoxyguanylat-Dinucleotideinnerhalb des prokaryonten Genoms oder innerhalb von Fragmentendesselben.
    [0028] Desweiteren basiert die Erfindung auf der Kenntnis, daß das erfindungsgemäße Proteinspezifisch an nicht methylierte CpG-Motive bindet. Diese spezifischeBindungseigenschaft des erfindungsgemäßen Proteins wird genutzt,um prokaryonte DNA zu binden und dadurch nachfolgend aus einer Probez.B. mit überwiegendemAnteil eukaryonter DNA anzureichern, zu trennen und zu isolieren.
    [0029] DerBegriff „Homologie" im Sinne der vorliegendenErfindung bezeichnet den Grad der Übereinstimmung von zwei Protein-Sequenzen.Dabei bedeutet x%ige Homologie, daß x von 100 Aminosäure-Positionen inden Sequenzen übereinstimmen.Der Ausdruck „verkürzt" wie er zur Charakterisierungdes erfindungsgemäßen Proteinsverwendet wird, bedeutet, daß dieLänge derAminosäuresequenzdes erfindungsgemäßen Proteins(CPGbP181) kürzerals die Längeder Aminosäuresequenzdes Wildtyp-CGPB-Proteins (CPGbP656) ist. Die Verkürzung erfolgtam N-terminalen und am C-terminalen Ende der Wildtyp-Proteinsequenz(1). Die größte Verkürzung stelltdabei die DNA-Bindestelle des Proteins dar. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Proteingegenüberdem Wildtyp-Protein auf maximal die DNA-Bindungsstelle verkürzt ist.
    [0030] Daserfindungsgemäße Proteinkann vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 19959 Dalton (nativ)bzw. 21444 Dalton (im Plasmid pQE60) aufweisen. In einer anderenbevorzugten Ausführungsformbeträgt derisoelektrische Punkt des erfindungsgemäßen Proteins etwa 10,09 (nativesProtein) bzw. 10,15 (im Plasmid pQE60). Ein besonders bevorzugteserfindungsgemäßes Proteinbesitzt die in SEQ ID No. 2 bzw. 1 dargestellteAminosäuresequenz.Dieses hat besonders gute Bindungseigenschaften gegenüber nichtmethylierten CpG-Motiven prokaryonter DNA.
    [0031] Dasin EP 02020904 beschriebeneProtein (CPGbP241), das eine verkürzte Variante des Wildtyp-CGPB-Proteins(CPGbP656) ist und als Grundlage für das erfindungsgemäße Protein(CPGbP181) diente, hat eine Längevon 241 Aminosäuren,ein Molekulargewicht von etwa 33650 Dalton (nativ) bzw. 28138 Dalton(im Plasmid pQE60) und einen isoelektrischen Punkt von 9,89 (nativ)bzw. 9,88 (im Plasmid pQE60). Die cDNA- und Aminosäuresequenzist in 1 und 2 gezeigt.
    [0032] DasWildtyp-CGBP-Protein hat eine Längevon 656 Aminosäuren,135 positiv und 94 negativ geladene Reste, ein Molekulargewichtvon etwa 75684 Dalton und einen isoelektrischen Punkt von 8,15.Die cDNA- und Aminosäuresequenzist in 1 gezeigt.
    [0033] DerSequenzvergleich des erfindungsgemäßen Proteins (CPGbP181) gemäß SEQ IDNo. 2 mit dem in EP 02020904 beschriebenenProtein (CPGbP241) ist in 1 und 2 dargestellt.
    [0034] Daserfindungsgemäße Proteinwird bevorzugt durch Klonierung der entsprechenden cDNA-Sequenz in ein Plasmidund Expression in Escherichia coli hergestellt. Ein das erfindungsgemäße Proteinexprimierender E.coli-Stamm wurde am 16. Februar 2004 unter derNr. DSM 16229 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturenhinterlegt. Alternativ könnenandere, dem Fachmann vertraute Verfahren zur Herstellung angewendetwerden. Die Nutzung des Plasmids pQE9 stellt dabei eine beispielhafteMöglichkeit dar,aber jedes andere geeignete Plasmid ist als Vektor einsetzbar. DieExpression in E. coli stellt ebenfalls nur ein Beispiel dar. EineExpression in anderen prokaryonten System als auch in einem eukaryontenSystem als auch die chemische oder enzymatische Synthese oder dieAufreinigung aus einer genetisch veränderter Tabakpflanze sind weiteremöglicheAusführungsformender Proteingewinnung. Das Protein kann sowohl im Labormaßstab (z.B.im Erlenmeyerkolben) als auch im industriellen Maßstab (z.B.Fermenter) hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Protein kann z.B. mittelsBindung von an den Anfang oder das Ende des Proteins eingebrachtenHistidin-Reste (His-tag) an eine geeignete nickelhaltige Matrixgereinigt werden, eine Methode, die dem Fachmann bekannt ist.
    [0035] WeitereMöglichkeitender Reinigung könnenjegliche Art von Fusionsproteinen sein, die eine Aufreinigung über geeigneteMatrices (Säulen,Gele, Beads etc.) erlauben. Andere Formen von tag's können Fusionspeptide/-proteine,z.B. Streptavidin-tag, Myc-tag und andere sein.
    [0036] Einebevorzugte Form des erfindungsgemäßen Proteins ist die nativeForm, aber auch eine denaturierte Form ist zur Bindung nicht methylierterCpG-Motive geeignet. Unter „denaturiertenFormen" im Sinneder vorliegenden Erfindung werden andere Sekundärstrukturen als die in derNatur vorkommenden verstanden.
    [0037] Dienative oder auch denaturierte Form des erfindungsgemäßen Proteinsstellt eine beispielhafte Ausführungsformdar. Die Erfindung schließtdie in vitro-Synthese sowie alle weiteren chemischen oder enzymatischenModifikation des Proteins ein, wie z.B. Einbau von Disulfidbrücken, Glykosylierungen,Phosphorylierungen, Acylierungen, Aminosäureaustausche sowie Fusionmit Proteinen oder anderen Molekülenein. Solche Modifikationen könnenz.B. durch Rekombination und/oder Expression und/oder chemischeund/oder enzymatische Modifikation einzelner oder mehrerer Aminosäuren erzieltwerden.
    [0038] Daserfindungsgemäße Proteinweist eine Vielzahl von Vorteilen auf. Es kann, besser als das Wildtyp-CGPB-Proteinoder Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie, prokaryonte DNA über nichtmethylierte CpG-Motive binden. Dadurch wird es möglich, aus einem Gemisch vonprokaryonter und eukaryonter DNA die prokaryonte DNA spezifischabzutrennen und/oder anzureichern. Dies ermöglicht letztendlich einen schnellenund einfachen Erregernachweis sowie eine frühzeitige Diagnose von Infektionen,die durch bakterielle Erreger verursacht sein können. Vice versa kann die Erfindungauch zur Abreicherung mikrobieller DNA im Sinne einer Reinigungbei klinischen Zuständenangewandt werden, die mit einem unphysiologischen Vorkommen vonBakterien oder deren Spaltprodukten Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut,von Patienten einhergehen. Dies gilt umso mehr, da gut belegt ist,daß Bakterienaber auch deren Spaltprodukte, wie beispielsweise bakterielle DNA,für eineVielzahl den Patienten schädigendenbiologischen Effekte verantwortlich sind.
    [0039] Gegenstandder vorliegenden Erfindung sind ferner Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Proteine gerichtetsind. Dabei kann es sich um mono- oder polyklonale Antikörper handeln.Sie könnenin an sich bekannter Weise hergestellt werden, wozu der Fachmanndie notwendigen Materialien und Methoden kennt.
    [0040] DieAntikörperkönnenzur Isolierung und Quantifizierung der erfindungsgemäßen Proteineverwendet werden. Auch hierbei handelt es sich um an sich bekannteEinsatzmöglichkeiten,für dieder Fachmann die notwendigen Materialien und Methoden kennt.
    [0041] Gegenstandder Erfindung ist ferner Nukleinsäure, insbesondere DNA, diefür einerfindungsgemäßes Proteinkodiert. Eine solche DNA ist die in SEQ ID No. 1 (oder 2)dargestellte.
    [0042] Aufgrundder guten Bindungsfähigkeitdes erfindungsgemäßen Proteinsan nicht methylierte CpG-Motive prokaryonter DNA ist weiterhin Gegenstandder Erfindung ein Verfahren zur Trennung und/oder Anreicherung prokaryonterDNA mit den Schritten a) Kontaktieren mindestenseiner in Lösungbefindlichen prokaryonten DNA mit dem erfindungsgemäßen Protein,wodurch ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird, und b) Separation des Komplexes.
    [0043] Diesekann aufgereinigt und wieder in Lösung gebracht sein oder direktin der Ursprungsquelle (z. B. Körperflüssigkeit,wie Blut, Serum, Trachealaspirat, Urin, bronchalveoläre Lavage,Nasenabstrich, Hautabstrich, Punktionsflüssigkeit) vorliegen.
    [0044] DieSeparation kann mittels verschiedener Verfahren zur Trennung, Isolierungoder Anreicherung von DNA-Protein-Komplexen oder DNA-Polypeptid-Komplexeerfolgen, die dem Fachmann hinlänglichbekannt sind. Dabei werden bevorzugt Methoden angewendet, bei denen dasDNA-bindende Protein an einen Träger immobilisiertist oder wird, um die DNA aus der Probelösung zu trennen und/oder anzureichern.
    [0045] Gemäß einerbevorzugten Ausführungsformschließtsich an die Separation ein Schritt zur Abtrennung der DNA vom erfindungsgemäßen Proteinaus dem Komplex an. Dies kann beispielsweise durch herkömmlicheVerfahren zur DNA-Aufreinigung erfolgen, die dem Fachmann bekanntsind. Im einfachsten Falle beruht die Abtrennung auf der Änderungdes pH-Wertes oderder Salzkonzentration (z. B. auf 1 M NaCl) des Mediums/Puffers oderder Zufügungchaotroper Reagenzien, etc; also geeignete Parameter, die zur Auflösung des Protein-DNA-Komplexesführen.Solche Methoden sind dem Fachmann bekannt.
    [0046] Gemäß einerweiteren bevorzugten Ausführungsformist das erfindungsgemäße Proteinan einen Trägergebunden. Diese Ausführungsformstellt eine besonders einfache Möglichkeitder Anreicherung prokaryonter DNA dar, da die Separation aus derLösungbesonders einfach, beispielsweise durch physikalischer Entfernung(z.B. Abzentrifugation) des oder der beladenen Träger ausder Lösung,erfolgen kann.
    [0047] Für die Lösung für die prokaryonteDNA kommt grundsätzlichjedes geeignete Lösungsmittelin Frage. Besonders zweckmäßig istdas Verfahren jedoch zur Anreicherung prokaryonter DNA aus Lösungen,die verschiedene biomolekulare Spezies, insbesondere verschiedenArten von DNA, enthalten. Die Erfindung betrifft vorzugsweise einVerfahren zur Trennung und Anreicherung prokaryonter oder viralerDNA aus einem Gemisch von prokaryonter und eukaryonter DNA. Dabeiwird beispielsweise die in Körperflüssigkeitenbefindliche prokaryonte DNA durch spezifische Bindung an das erfindungsgemäße Proteinvon der eukaryonten DNA getrennt und angereichert. Die so angereicherteprokaryonte DNA erleichtert den Nachweis prokaryonter Erreger mitHilfe molekularbiologischer Methoden und kann zur Diagnose von Krankheiten,die durch pathogene Erreger verursacht werden, beitragen.
    [0048] Insbesonderedie Ausführungsform,bei der das erfindungsgemäße DNA-bindendeProtein an die Oberflächeeines Trägersimmobilisiert ist, eignet sich füreine Adsorption prokaryonter DNA aus Körperflüssigkeiten, vorzugsweise ausdem Blut. Dieser Ansatz bietet überdiesdie Möglichkeit,mikrobielle DNA, die im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten vorliegt, aus diesenzu entfernen. Die so von der mikrobiellen DNA, die auch allein inder Lage ist, schwere Entzündungsreaktionenbei Patienten auszulösen,gereinigte Körperflüssigkeit(z. B. Vollblut, Serum oder Liquor), kann dann in den Körper zurückgeführt werden.Dieses Prinzip kann also zur Abreichung prokaryonter DNA aus physiologischenFlüssigkeitenim Sinne der Reinigung eingesetzt werden, wobei die speziellen Bindungseigenschaftendes erfindungsgemäßen Proteinsgenutzt werden.
    [0049] AlsKörperflüssigkeitenim Sinne der Erfindung werden alle vom Körper eines Säugers, einschließlich Mensch,stammenden Flüssigkeitenverstanden, insbesondere solche in denen Krankheitserreger vorkommen können, wiez. B. Blut, Urin, Liquor, Pleural-, Perikardial-, Peritoneal- sowieSynovialflüssigkeit.Die auf humanes Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stelltkeine Einschränkungsondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
    [0050] Unterbakteriellen Erregern werden vorzugsweise Erreger einer Sepsis,aber auch alle anderen bakteriellen Erreger von Infektionen verstanden.Sie könnensich dabei von kommensalen Erregern unterscheiden, die zur normalenBesiedlung des Organismus gerechnet werden und gelegentlich auchin Untersuchungsproben von Patienten gefunden werden, aber keineklinische Bedeutung haben.
    [0051] Beider Isolierung der Gesamt-DNA aus infizierten Körperflüssigkeiten kann das Verhältnis Wirts-DNA zurErreger-DNA oft nur 1:10 bis 1:10–8 odersogar noch weniger betragen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durchdie spezifische Bindung prokaryonter DNA an das erfindungsgemäße Proteineine Anreicherung um 1 Potenzeinheit und mehr.
    [0052] Daserfindungsgemäße Proteinkann direkt oder indirekt an den Träger gekoppelt sein. Die Artder Kopplung hängtvon dem Trägerund dem Trägermaterialab. Als Trägerkommen dabei insbesondere Membranen, Mikropartikel und Harze oder ähnlicheMaterialien fürAffinitätsmatricesin Frage. Geeignete Materialien zur Anbindung des erfindungsgemäßen Proteins,sowie – abhängig vonder Art des Materials – dieDurchführungder Anbindung, sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Für die indirekteKopplung eignen sich beispielsweise spezifische Antikörper gegendas erfindungsgemäße Proteinoder das Polypeptid, die ihrerseits durch bekannte Verfahren anden Trägergebunden sind.
    [0053] EineAnwendung des erfindungsgemäßen Verfahrensbesteht in der Anreicherung prokaryonter DNA. Eine weitere Anwendungbesteht in der Trennung von prokaryonter DNA aus einem Gemisch eukaryonterund prokaryonter DNA durch die Bindung der prokaryonten DNA an daserfindungsgemäße Protein,welches z.B. an eine Matrix immobilisiert wurde. Das Gemisch auskörpereignerund prokaryonter DNA wird mittels geeigneter Verfahren mit der Affinitätsmatrixin Verbindung gebracht, und dabei wird die prokaryonte DNA an das immobilisierteerfindungsgemäße Proteingebunden; die eukaryonte DNA durchläuft zum Beispiel eine Trennsäule undkann separat gesammelt werden. Affinitätsmatrices können beispielsweisepolymere Polysaccharide, wie Agarosen, andere Biopolymere, synthetischePolymere, oder Trägermit Silikat-Grundgerüst,wie poröseGläseroder sonstige feste oder flexible Träger, sein, an welchen das erfindungsgemäße DNA-bindende Proteinimmobilisiert wird. Nach erfolgter Trennung prokaryonter von eukaryonterDNA wird die Affinitätsmatrix miteinem geeigneten Reagenz gespült,so daß entwederdas Bindungsprotein mit der gekoppelten prokaryonten DNA von derMatrix und/oder die prokaryonte DNA von dem Bindungsprotein getrenntwird und fürweitere Arbeitsschritte in ausreichender Menge zur Verfügung steht.
    [0054] Eineweitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in derTrennung und Anreicherung prokaryonter DNA von eukaryonter DNA durchBindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Proteinwelches an Mikropartikeln immobilisiert wurde. Hierbei kommen alleMikropartikel in Frage, die eine Immobilisierung des DNA-bindendenerfindungsgemäßen Proteinsermöglichen.Solche Mikropartikel können ausLatex, Kunststoff (z. B. Styropor, Polymer), Metall oder ferromagnetischenStoffen bestehen. Weiterhin könnenauch fluoreszierende Mikropartikel, wie sie beispielsweise von derFirma Luminex angeboten werden, verwendet werden. Nachdem die prokaryonteDNA an die an Mikropartikel immobilisierten erfindungsgemäßen Proteinegebunden wurde, werden die Mikropartikel mit geeigneten Methoden,wie beispielsweise Filtration, Zentrifugation, Fällung, Sortierung über Messungder Fluoreszensintensitätoder magnetische Verfahren, von dem Stoffgemisch getrennt. Die prokaryonteDNA steht nach Trennung von den Mikropartikeln zur weiteren Verarbeitungzur Verfügung.
    [0055] Eineandere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in derTrennung und Anreicherung prokaryonter DNA von eukaryonter DNA durchBindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Protein,welches anschließenddurch Elektrophorese von übrigenBestandteilen des Gemisches getrennt wird.
    [0056] Eineweitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in derTrennung und Anreicherung prokaryonter DNA von eukaryonter DNA durchBindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Protein,wobei das erfindungsgemäße Proteinanschließendan entsprechende Antikörpergebunden wird. Die Antikörperkönnenan feste oder flexible Substrate, z. B. Glas, Kunststoffe, Silizium,Mikropartikel, Membranen gebunden sein, oder sich in Lösung befinden.Nach Bindung der prokaryonten DNA an das erfindungsgemäße Proteinund dessen Bindung an den spezifischen Antikörper erfolgt die Trennung ausdem Stoffgemisch mit dem Fachmann bekannten Methoden.
    [0057] Daserfindungsgemäße Verfahrenkann auch zur Reinigung von Körperflüssigkeitenvon prokaryonter DNA eingesetzt werden. Hierbei ist es zweckmäßig, daß die Separationextrakorporal unter sterilen Bedingungen erfolgt, damit die Körperflüssigkeitenwieder in den Körperzurückgeführt werdenkönnen,so daß daskörpereigeneImmunsystem bei der Beseitigung von Infektionen unterstützt wird,indem die sich in den Körperflüssigkeitenbefindende prokaryonte DNA entfernt wird.
    [0058] Beider extrakorporalen Entfernung der prokaryonten DNA aus Körperflüssigkeitenkommen alle geeigneten chemischen, mechanischen oder elektrochemischenVerfahren in Betracht. Weiterhin stellt auch die Kombination mitanderen extrakorporalen Verfahren, wie Hämoperfusion, Herz-Lungen-Maschineoder Endotoxin-Adsorber, eine weitere zweckmäßige Anwendung dar.
    [0059] Daserfindungsgemäße Proteinkann auch zur Detektion prokaryonter DNA eingesetzt werden. Hierbei schließt sichnach der Anreicherung der prokaryonten DNA ein Schritt zur Amplifikationder prokaryonten DNA an, wozu sich alle gängigen Amplifikationsmethodeneignen (PCR, LCR, LM-PCR etc.).
    [0060] DieErfindung betrifft darüberhinaus einen Kit zur Anreicherung prokaryonter DNA mittels einesder vorstehend beschriebenen Verfahren, in dem zumindest das erfindungsgemäße Proteingegebenenfalls zusammen mit weiteren geeigneten Reagenzien zur Verfahrensdurchführung enthaltensind.
    [0061] DerKit kann neben dem erfindungsgemäßen Proteinmindestens ein Set von Primern, welche zur Amplifikation genomischerDNA bestimmter Prokaryonten unter Standardbedingungen geeignet sind,enthalten.
    [0062] Daserfindungsgemäße Verfahren,insbesondere mit den vorstehend beschriebenen Ausführungsformenhat den Vorteil, daß durchspezifische Bindung nicht-methylierter CpG-motiv-reicher prokaryonter DNA an Proteinemit spezifischer Affinitätfür solcheStrukturen eine Konzentrierung prokaryonter DNA aus der Gesamt-DNAeines infizierten Wirts gelingt und damit die Nachweisempfindlichkeitfür Verfahrenzum Nachweis von Erreger-DNA in Körperflüssigkeiten stark erhöht wird.
    [0063] DieAbtrennungsmöglichkeitenprokaryonter DNA von eukaryonter DNA mit einem spezifisch bindendenProtein sind nicht zeitaufwendiger als bekannte Methoden zur Isolierungvon Gesamt-DNA. Der nachfolgende DNA-Nachweis kann über einePCR-Reaktion erfolgen. Eine nested PCR wird in den meisten Fällen nichtnotwendig sein, so daß einebeträchtlicheZeitersparnis in der Diagnostik möglich wird.
    [0064] Bereitsvorstehend wurde angesprochen, das erfindungsgemäße Protein zur Abreicherungprokaryontischer DNA in physiologischen Körperflüssigkeiten einzusetzen. Abreicherungim Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet dabei, daß die Mengeder prokaryontischen DNA verringert wird. Diese Möglichkeitzur Verringerung der prokaryontischen DNA ermöglicht es auch, die erfindungsgemäßen Proteinein der Umwelttechnik, der Abwasserwirtschaft und der Klimatechnikeinzusetzen.
    [0065] DieErfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele erläutert, ohnesie aber darauf einzuschränken.
    [0066] Ausder DNA Sequenz fürdas komplette CPGbP Protein wurden die Primer 1 (GGATCCGGTGGAGGGCGCAAGAGGCCTG-fw,SEQ ID Nr. 3) und 2 (AAGCTTAGAGGTAGGTCCTCAT-CTGAG-rv, SEQ ID Nr.4) konstruiert, die ein verkürztesDNA-Fragment amplifizieren, das für ein verkürztes CPG-bindendes Protein,CPGbP181, kodiert. Das DNA-Fragment wurde nach Spaltung mit denRestriktionsenzymen BamHI und Hind III in den Vektor pQE9 (Qiagen)ligiert. In pQE9 entsteht ein offener Leserahmen, in dem an das5' Ende ein für 6 × His-Tagkodierendes DNA Fragment fusioniert wird (pQE9[6HisCPGbP181]).
    [0067] DasPlasmid pQE9[6HisCPGbP181] wurde in den E. coli ExpressionsstammM15[REP4] (Qiagen) transformiert. Der Klon wird im weiteren M15[CPGbP181]bezeichnet und das exprimierte Protein rCPGbP181. Die Expressiondes Proteins rCPGbP181 erfolgte nach folgendem Protokoll: Eine Koloniedes Expressionsstammes M15[CPGbP181J wird in 2 ml Luria Mediummit 100 μg/mlAmpicillin und 25 μg/mlKanamycin bei 37°Cunter Schütteln über Nachtangezüchtet.Anschließendwird die Vorkultur in 200 ml vorgewärmtes Nährmedium, das die gleichenAntibiotikakonzentrationen enthält, überführt. Nach3 Stunden Wachstum bei 37°Cunter Schüttelnwird IPTG zur Induktion der Expression zugegeben und weitere 5 Stundeninkubiert. Danach werden die Bakterien abzentrifugiert und das Sedimentin 5 ml 0.2 M Trispuffer, pH 7.5 resuspendiert. Die Bakterien werdenim Eisbad 5 × 1min mit Ultraschall behandelt. Nach der Zentrifugation wird das Sedimentin 10 ml 0.2 M Tris, 2M Harnstoff, pH7.5 resuspendiert und 15 mingeschüttelt.Nach erfolgter Zentrifugation wird das verbliebene Sediment in 0.2M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02M Imidazol aufgenommen und suspendiert. Die Inclusionbodies werdenunter Agitation für1 Stunde bei Raumtemperatur gelöst.Nach Zentrifugation befindet sich das Rohprotein im Überstandund kann direkt auf eine 3 ml Ni-Agarosesäule aufgetragen werden. DienächstenSchritte sollten im Kühlraumbei +4 bis +6°Cerfolgen. Zunächstwird die Säulemit 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE),0.02 M Imidazol Puffer, pH7.5 gewaschen bis die Extinktion die Nulllinieerreicht hat. Von hier aus kann rCPGbP181 auf verschiedenen Wegengewonnen werden: 1. Als denaturiertes Protein gelöst in 6MGuanidinhydrochlorid oder 6 M Harnstoff und 2. als natives Proteinlöslichin Puffern physiologischer Konzentration. Im 2. Fall ist die Ausbeuteaber geringer.
    [0068] DasProtein rCPGbP181 wird von der Ni-NTA Agarose mit einem Imidazolgradientenvon 0–0.5M eluiert M in dem Puffer 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol, pH7.5 als Grundlage. Dabeiwird rCPGbP181 bei 0.2–0.3M Imidazol von der Säuleabgelöst.Das so gewonnene Protein wird gegen 0.2 M Tris, 6M Harnstoff, 0.001M Dithioeritrit (DTE), pH7.5 dialysiert und eingefroren. Bei Dialysegegen physiologische Puffer fälltso gereinigtes rCPGbP181 aus.
    [0069] Nachdieser Methode wird die Guanidinhydrochlorid Konzentration von 6molar auf der Ni-NTA Agarose mit dem gebundenem rCPGbP181 über einenGradienten auf 0 molar Guanidinhydrochlorid gebracht. Grundlageist der Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M Dithioeritrit (DTE),0.02 M Imidazol, pH7.5. Die Flussgeschwindigkeit betrug 0.5 ml/min.Danach wurde zur Elution ein Imidazolgradient von 0 bis 0.5 molarangelegt in Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.001 M Dithioeritrit(DTE), pH7.5 als Grundlage. Auch hier wurde ein wesentlicher Anteildes gebundenen Proteins (20%) bei 0.2 bis 0.3 molar Imidazol eluiert.Dieses native rCPGbP181-Eluat blieb in diesem Puffer gelöst, auchnach Dialyse in PBS. Von Nachteil ist aber, dass ca. 80% des anNi-NTA Agarose gebundenen rCPGbP181 unter diesen Bedingungen aufder Säuleverblieben und nachträglichnur unter den denaturierenden Bedingungen von Methode 1 noch gewonnenwerden konnten. Das heißt,die Ausbeute der verwendeten Methode 2 ergab nur 20% natives, inphysiologischen Puffern löslichesrCPGbP181.
    [0070] Frisches,heparinisiertes Humanblut, das Streptococcus pyogenes mit 103/ml koloniebildende Einheiten als Erregerenthält,wird fürden Erregernachweis verwendet. Die DNA wird mittels Absorption anDNA bindende Matrix mit kommerziellen Kits zur Isolierung von Gesamt-DNAaus Körperflüssigkeitennach abgewandelter Vorschrift der Hersteller isoliert. Dazu werden100 μl infiziertesBlut in Eppendorf Tubes mit 200 μldes Totallysispuffers versetzt, der Proteinase K und SDS enthält. DasGemisch wird 30 min bei 37°Cinkubiert, und danach 20 min auf 95°C erhitzt. Nach dem Abkühlen werden20 μg Mutanolysinzugegeben und weitere 60 min bei 37°C inkubiert. Nach Zentrifugationwird das Gemisch auf die Zentrifugationssäulchen mit DNA- bindender Matrixaufgetragen und die DNA nach Vorschrift des Herstellers gereinigt.Die gereinigte DNA wird in einem Endvolumen von 100 μl 0.01 molarTrispuffer, pH 7.5 oder in gleicher Menge Elutionpuffer des Herstellersaufgenommen. Fürden Erregernachweis wurden Primer zur Identifizierung des StreptolysinO Gens (slo) konstruiert.
    [0071] In 3 istdie 1. PCR von Streptokokken-DNA in Hummanblut dargestellt (je 10 μl des 25 μl Ansatzes aufgetrennt:1) PCR Ansatz mit 5 μlTemplate DNA; 2) Ansatz mit 5 μlTemplate, 1 : 10 verdünnt.3) Positivkontrolle: 0.2 μlStreptokokken-DNA als Template ohne Anwesenheit eukaryotischer DNAaus Blut. ST) Molekulargewichtsstandard) Ergebnis: Die 1. Primär-PCR ergibtkeine positive Reaktion. Deshalb wurde nachfolgend eine 2. PCR (nested PCR)durchgeführt.
    [0072] In 4 istdie nested PCR mit den PCR-Produkten aus dem Primär-PCR-Ansatzin 3 als Template gezeigt. Die Proben entsprechendenen aus 3.
    [0073] Ergebnis:In der nested PCR wird das gewünschteslo-DNA Fragment amplifiziert bei einer Konzentration von 100 Streptokokkenzellenpro 100 μlBlut (Probe 1). Das entspricht bei 5 μl Einsatz in der 1. PCR (3)ca 5 bis 10 Templates. Bei einer 1:10 Verdünnung (Probe 2) ist die Empfindlichkeiterschöpft(0,5 bis 1 Template).
    [0074] Ausdiesen Versuchen ist ersichtlich, dass für einen erfolgreichen PCR-Nachweisvon Erregern im Blut die Gesamt-DNA aus mindestens 1 bis 5 ml Blutisoliert werden muss. Die Gesamt-DNA-Konzentrationist dann aber zu groß,um direkt in einer PCR eingesetzt zu werden.
    [0075] Andereerregerspezifische Nukleinsäurenachweiseohne Amplifikationsschritt durch direkte Detektion der bakteriellenDNA, z.B. mittels DNA-Hybridisierung, sind ebenfalls zu unempfindlich,was vor allem am hohen Überschussvon humaner DNA gegenüberbakterieller DNA liegt. Hierbei sind zudem kompetitive Prozessebei der DNA-Analyse sowie die geringe Menge an bakterieller DNAals hinderlich füreine qualitative und quantitative Analyse anzusehen. Die üblichenMethoden zur DNA-Isolierung reichern die Gesamt-DNA einer Körperflüssigkeitan, sodass das VerhältnisWirts-DNA zu mikrobieller DNA zwischen 1 : 10–6 und1 : 10–8 betragenkann. Aus diesem Unterschied ist die Schwierigkeit des Nachweisesmikrobieller DNA in Körperflüssigkeitengut nachzuvollziehen.
    [0076] InGelretardierungsexperimenten wurde sowohl die Bindung des denaturiertenals auch die des nativen Proteins rCpGbP181 an methylierte und nicht-methylierteDNA-Molekülemit CpG-Motivenuntersucht. Als Test-DNA wurde das E. coli Plasmid pUC18 verwendetmit einem inserierten M-Proteingensegment von Streptococcus dysgalactiaesupsp. equisimilis (Geyer et. al. FEMS Immunol. Med. Microbiol.26: 11-24, 1999). Die Plasmidpräparationwurde geteilt und die eine Hälftemit dem CpG-Methylase-Kit von New England Biolabs methyliert. BeidePräparationenwurden mit rCPGbP181 (nativ oder denaturiert) gemischt und im Agarosegel elektrophoretischaufgetrennt. Die Ergebnisse sind in den 5 und 6 einzusehen.Sowohl rCPGbP181 in nativer als auch in denaturierter Form zeigtehöhereAffinitätzur nichtmethylierten Plasmid-DNA, was die selektive Bindungseigenschaftfür nichtmethylierteCpG-reiche DNA bestätigt.
    [0077] Beschreibungdes Gelretardierungsexperiment gemäß 5: Je 5 μl (72 ng)methylierte und 1 μl(142 ng) nicht methylierte pUC18emm DNA wurden mit 5 μl (0.5 μg) nativemrCPGbP181 gemischt und auf ein Volumen von 35 μl mit dem Puffer: 0.01 M Tris,0.08M NaCl, 0.001 M EDTA, 0.005M DTE, 5% Glycerin, pH7.8 aufgefüllt. Nach30 min Inkubation bei 20°Cwurden die Gemische elektrophoretisch in 1.5%iger Agarose aufgetrennt.In Lanes 1 und 3 wurde methylierte DNA und inLanes 2 und 4 nichtmethylierte DNA aufgetragen.In Lanes 1 und 2 wurde die DNA mit nativem rCPGbP181gemischt. Lane 2 zeigt, dass nichtmethyliertes pUC18emmmit rCPGbp181 interagiert, keine Wechselwirkung zeigte dagegen rCPGbP181mit methyliertem pUC18emm (Lane 1). Lanes 4 und 5 sinddie Plasmide ohne Zusatz von rCPGbP181 als Kontrollen.
    [0078] Beschreibungdes Gelretardierungsexperiment aus 6 von nichtmethyliertem und methyliertem pUCl8emm nach Inkubation mit denaturiertemrCPGbP181. Die Konzentrationen entsprechen denen von 5.In Lanes 1 und 3 wurde methylierte DNA und inLanes 2 und 4 nichtmethylierte DNA aufgetragen.In Lanes 1 bis 4 wurde die DNA mit zwei verschiedenenChargen von denaturiertem rCPGbP181 gemischt. Lanes 2 und 4 zeigen,dass nichtmethyliertes pUC18emm auch mit denaturiertem rCPGbP181interagiert, keine Wechselwirkung zeigte dagegen rCPGbP181 mit methyliertempUC18emm (Lanes 1 und 3). Lane 5 pUC18emmohne rCPGbP181 als Kontrolle.
    [0079] GereinigtesCPGbp181 wurde mittels Glutaraldehyd an Aminohexyl-Sepharose (Amersham-Biosciences) nachder Vorschrift von Cambiasso et al. (Cambiasso, C. et al., Immunochemistry12: 273–278,1975) gekoppelt. Die immobilisierte Proteinkonzentration betrug0.3 mg pro Milliliter Sepharose. 300 μl Sepharose wurden in ein Spin-FilterRöhrchenmit innertem Frittenmaterial gegeben, das weder DNA noch Proteinabsorbiert, jedoch die Sepharose zurückhält.
    [0080] 200ng Kalbsthymus-DNA (eukaryontische DNA) und 25 ng pUC18emm (prokaryontischeDNA) wurden in 100 μl20 mM Tris-HCL Puffer, pH 7.5 gelöst und auf das so präparierteSäulchengegeben. Nach jedem Schritt wurde die Flüssigkeit 0,5 min bei 14 000Umdrehungen pro Minute in einer Eppendorfzentrifuge in je ein frischenEppendorfröhrchenzentrifugiert. So wurde die NaCl-Konzentration in Stufen von 50mM von 0 auf 1000 mM erhöht.In jedem Röhrchen wurdeeine DNA-Fällungdurchgeführtindem 10 μl4 M Acetat, pH4,5 und 250 μlabs. Ethanol zugegeben wurden, anschließend gemischt wurden und dann15 min bei 14 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wurden. Danachwurde der Überstandabgegossen und das Präzipitatwurde mit 300 μl70%igem Ethanol gewaschen: Nach Abgießen wurde der Rückstand5 min in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und anschließend in15 μl dest.Wasser (PCR-tauglich) aufgenommen. Zum einen wurde die Extinktionbei 254 nm von je 10 μlder Proben gemessen (7). Zum anderen wurde mit je3 μl jederProbe eine PCR mit Sequenzprimern für PUC18 durchgeführt (8).
    [0081] DasErgebnis (7, 8) zeigt,daß dieeukaryontische Kalbsthymus-DNA am Anfang zwischen 0 bis 0,1 M NaClvon der Säulegewaschen wird, währenddie prokaryontische DNA (pUC18emm) in der Fraktion bei 0.35 M NaCleluiert wurde. Das zeigt, dass eukaryontische DNA eine niedrigereAffinitätzu CPGbP181 aufweist und somit eine eindeutige Trennung beider DNA-Fraktionenerreicht wurde.
    SEQUENZPROTOKOLL



    权利要求:
    Claims (29)
    [1] Protein, das nicht methylierte CpG-Motive bindet,wobei es eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Proteinaufweist und gegenüberdiesem verkürztist, wobei die Bindungsstelle fürnicht methylierte CpG-Motive erhalten ist.
    [2] Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeies die Aminosäure-Sequenzgemäß SEQ ID No.2 aufweist.
    [3] Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeies durch Modifikation hergestellt ist.
    [4] Protein nach Anspruch 3, wobei die Modifikation durchRekombination und/oder Expression und/oder chemische und/oder enzymatischeModifikation einzelner oder mehrerer Aminosäuren erzielt wird.
    [5] Protein nach Anspruch 4, wobei die Modifikation durchden Einbau von Disulfidbrücken,Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acylierungen, Aminosäureaustauschesowie Fusion mit weiteren Proteinen oder anderen Molekülen erreichtwird.
    [6] Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeies bis maximal auf die Längeder Bindungsstelle verkürztist.
    [7] Antikörpergegen die gemäß den vorhergehendenAnsprüchendefinierten Proteine, wobei die Antikörper monoklonale oder polyklonaleAntikörpersind.
    [8] Verwendung der Antikörper nach Anspruch 7 zur Isolierungund Quantifizierung des Proteins, wie es gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 definiert ist.
    [9] Verfahren zur Trennung und/oder Anreicherung prokaryonterDNA mit den Schritten: a) Kontaktieren mindestens einer inLösungbefindlichen prokaryonten DNA mit dem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis7, wodurch ein Protein-DNA-Komplexgebildet wird, und b) Separation des Komplexes.
    [10] Verfahren gemäß Anspruch9, wobei sich an die Separation ein Schritt zur Abtrennung der DNAvom Protein aus dem Komplex anschließt.
    [11] Verfahren gemäß Anspruch9 oder 10, wobei das Protein an einen Träger gebunden ist.
    [12] Verfahren gemäß Anspruch11, wobei das Protein direkt an den Träger gebunden ist.
    [13] Verfahren gemäß Anspruch11, wobei das Protein übereinen dagegen gerichteten Antikörperan den Trägergebunden ist.
    [14] Verfahren gemäß einemder Ansprüche11 bis 13, wobei der Trägerals Matrix, Mikropartikel oder Membran ausgebildet ist.
    [15] Verfahren gemäß einemder Ansprüche9 bis 14, wobei die Separation mittels eines gegen das Protein gerichtetenAntikörperoder Antiserum erfolgt.
    [16] Verfahren gemäß einemder Ansprüche9 bis 14, wobei die Separation mittels Elektrophorese erfolgt.
    [17] Verfahren gemäß einemder Ansprüche12 bis 16, wobei das Protein ein gegen nichtmethylierte CpG-Motivegerichteter Antikörperoder ein entsprechendes Antiserum ist.
    [18] Verfahren gemäß einemder Ansprüche9 bis 17, wobei die Lösungein Gemisch aus eukaryonter und prokaryonter DNA enthält.
    [19] Verfahren gemäß Anspruch18, wobei die Lösungeine Körperflüssigkeitoder davon abgeleitet ist, insbesondere Vollblut, Serum, Plasma,Zellpräparationenaus Vollblut, Urin, Liquor, Pleural-, Perikardial-, Peritoneal-,Synovialflüssigkeitund bronchoalveoläreLavage.
    [20] Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Separationmittels eines Filters erzielt wird, welcher entsprechende DNA-Protein-Komplexeherausfiltert.
    [21] Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Protein aufeiner Filtermatrix immobilisiert ist.
    [22] Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 21 zur Anwendungin der Umwelttechnik, der Wasser- und Abwasserwirtschaft sowie derKlimatechnik.
    [23] Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 21, wobei weiterhinnach Schritt b) als Schritt c) die prokaryonte DNA amplifiziertwird.
    [24] Verfahren nach Anspruch 23, mit den Schritten: a)Isolierung der prokaryonten DNA aus dem Protein DNA-Komplex, b)Denaturierung der doppelsträngigeDNA, c) Hybridisierung der Einzelstränge der DNA mit komplementären Primern, d)Generierung von Doppelstrangfragmenten über Reaktion mit Polymerasenund e) Wiederholung dieser Schritte zum gewünschten Amplifikationsgrad.
    [25] Verfahren nach Anspruch 24, mit den Schritten: a)Klonierung der isolierten prokaryonten DNA-Sequenzen in Vektoren, b)Transformation geeigneter Wirtszellen mit diesen Vektoren, c)Kultivieren dieser transformierten Zellen, d) Isolation derVektoren aus diesen Zellen und e) Isolierung der DNA.
    [26] Kit zur Anreicherung prokaryonter DNA mittels einesVerfahrens nach einem der Ansprüche9 bis 25.
    [27] Test-Kit zur Detektion prokaryonter DNA mittelseines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 25 mit einem odermehreren Sets spezifischer Primer.
    [28] Verwendung der Proteine nach den Ansprüchen 1 bis6 für dasScreening von Substanzbibliotheken bezüglich ihrer Bindeeigenschaftenan proteingebundene DNA-Sequenzen.
    [29] Nukleinsäure,kodierend fürein Protein nach einem der Ansprüche1 bis 6.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-09-22| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2011-07-29| R018| Grant decision by examination section/examining division|
    2012-06-14| R020| Patent grant now final|Effective date: 20120309 |
    2018-10-02| R119| Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee|
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